肉與肉制品中四環素族抗生素殘留量檢驗

1 適用范圍

本方法適用于肉和肉制品中四環素族抗生素殘留量的檢驗 

2 原理概要

四環素族 (四環素 土霉素 金霉素) 抗生素具有很強的抑菌作用。 在接有特定微生物的平板培養基上放入牛津杯， 在牛津杯內加滿試樣溶液 培養后測量抑菌圈的大小。 

3 主要儀器和試劑與培養基

3.1  試劑： 

3.1.1  磷酸鹽緩沖液(pH4.5) 

稱取磷酸二氫鉀 13.6g， 溶解于蒸餾水中， 定容到 1000mL， 高壓滅菌 115℃，30min 冷卻后置4℃ 冰箱內保存。 

3.1.2  生理鹽水稱取氯化鈉8.5g溶解于1 000mL蒸餾水中， 高壓滅菌115℃ 30min。 

3.1.3  鹽酸 0.1mol/L溶液 

3.1.4  標準四環素原液： 精確稱取四環素 50mg， 用0.1mol/L 鹽酸1 mL 溶解， 用水定容到 1 000mL， 在 4℃ 冰箱中可保存一周。 

3.2  培養基 

3.2.1  菌種培養基 

胰蛋白胨           10.0g

牛肉膏             5.0g

氯化鈉             2.5g

瓊脂               14.0- 16.0g

蒸餾水             1 000mL

將以上成分加熱溶解， 高壓滅菌 121℃ 15min 最終pH6.5± 0.1 

3.2.2  檢定用培養基 

胰蛋白胨    6.0g

牛肉膏      1.5g

酵母膏      3.0g

瓊脂        14.0 -16.0g

蒸餾水      1 000mL

將以上成分加熱溶解 高壓滅菌 121℃ 15min 最終pH5.8± 0.1 

3.3  儀器

3.3.1  培養皿： 內徑90mm,底部平整光滑 ，具陶質蓋。 

3.3.2  牛津杯： 內徑6 ±0.1mm ，外徑7.8 ±0.1mm 高度10± 0.1mm 

3.3.3  游標卡尺 ：測量抑菌圈直徑用 

3.3.4  均質器 

3.3.5  離心機

3.3.6  恒溫水浴 

3.3.7  恒溫培養箱 

3.3.8  電熱干烤箱170 ±0.1℃ 

4 過程簡述

4.1  檢樣液的制備

稱取試樣10.0g 加入0.1mol/L磷酸緩沖液 20mL，小心攪勻放置60min 然后于均質器中均質 (3000- 6000r/min)1min， 經4 000r/min離心10min， 其上清液為檢樣液。 

4.2  菌液和檢定用平板的制備

4.2.1  菌液的制備

菌種： 蠟樣芽孢桿菌 (Bac cereus ATCC 11778) 由衛生部藥品生物制品檢定所提供。 

將菌種移種于盛有300mL菌種培養基的克氏瓶中， 于30℃ 培養箱中培養 7天。鏡檢芽孢數達到 85 %以上， 用生理鹽水 25mL 洗下菌苔， 置 65℃ 恒溫水浴中加熱30min， 離心(2000r/min)20min 棄去上清液 ，如此重復洗滌芽孢懸液三次。 再置于65℃ 恒溫水浴加熱 30min ，然后取生理鹽水50mL制成芽孢懸液。 置4℃ 冰箱中可保存一個月 

4.2.2  蠟樣芽孢桿菌懸液用量的測定

在實際檢定前先試幾個平板， 即把不同濃度的芽孢懸液加入檢定用培養基中，使0.05ug/mL濃度的標準四環素溶液可產生 12mm以上的清晰 、完整的抑菌圈作為最適芽孢用量。 一般用量為每 100mL檢定用培養基內加芽孢懸液0.5- 1.0mL ，1.0mL菌懸液中含芽孢數約為 10⁶

4.2.3  檢定用平板的制備

將適量芽孢懸液加入溶化后冷卻至 55- 60℃ 的檢定用培養基中混勻。 每個平皿內加入培養基6mL， 前后搖動平皿， 使含有芽孢的檢定培養基均勻覆蓋于平皿表面，置水平位置上蓋上陶質蓋， 待凝固后， 于每個平板的培養表面放置6個牛津杯， 使牛津杯在半徑為2.8cm的圓面上成60度角的間距。所用平板須當天制備。 

4.3  檢定

4.3.1  標準曲線的繪制

四環素稀釋液 取原液用 0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液稀釋成0.025、 0.050、 0.100、0.200、 0.400、 0.800u g/mL 的標準溶掖 (當天用當天稀釋)。 

取檢定用平板18個 ，分成6組， 每組3個平板作為平行試驗。 第一組于每個平板的6個牛津杯中分別加滿 0.025u g/mL的標準溶液作為對照組。 第二到第六組于每個平板上的6個牛津杯中， 間隔加滿0.200u g/mL的標準溶液作為參考。 各組余下的牛津杯， 根據組別順序依次加滿 0.050 、0.100 、0.200、0.400 、0.800 ug/mL的標準溶液 ，經培養后 ，以各組抑菌圈直徑的校正平均值繪制標準曲線。 抑菌圈直徑校正值 (mm) 等于2 -6組 (0.200ug/mL) 抑菌圈直徑的平均值減去各組抑菌圈直徑平均值。 用此校正值校正 0.050、 0.100 、0.200 、0.400 、0.800 ug/mL標準溶液的抑菌圈直徑平均值.。 

校正后的值 ，包括 0.200ug/mL 濃度的平均值在半對數坐標紙上作圖, 以抑菌圈直徑為橫坐標 (算術級), 以濃度為縱坐標 (對數級) 通過下列公式繪出標準曲線

L = (3a +2b+ c- e)/5

H = (3e+ 2d+ c- a)/5

式中： L—標準曲線的最低濃度的抑菌圈直徑； a b e相應濃度是 0.050、 0.100、0.800u g/mL。 

H —標準曲線的最高濃度的抑菌圈直徑； a d e相應濃度是 0.050、 0.400 、0.800ug/mL 

c—參考濃度(0.200u g/mL)的 45個抑菌圈直徑的平均值。 

4.3.2  試樣中四環素族抗生素殘留量的檢定

每份試樣取 3個檢定用平板， 在每個檢定用板上， 間隔的 3個牛津杯內加滿四環素標準參考濃度溶液。 另外3個牛津杯加滿被檢試樣液， 將陶質蓋重新蓋好， 置30 ±1℃ 培養箱中， 培養 17± 1h 除去牛津杯翻轉平板， 精確的測量產生的抑菌圈直徑 (精確到 0.1mm)。 分別求出 3個檢定用平板上參考濃度和被檢試樣抑菌圈直徑數值校正后，從四環素標準曲線上查出被檢試樣中四環素的含量。 

5 結果計算