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    出口食品小腸結腸炎耶爾森氏菌檢驗方法



    錄入時間:2006-6-26 9:00:51 來源:其它

       
                       中華人民共和國進出口商品檢驗行業標準 
       出口食品小腸結腸炎耶爾森氏菌檢驗方法  SN 0174—92 代替ZB X04 003—86
           Method for detection of Yersinia enterocciitica in food for export
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    1 主題內容與適用范圍

      本標準規定了出口冷凍和生鮮的豬肉、豬舌、雞肉、蝦和蝦仁中小腸結腸炎耶爾森
    氏菌(以下簡稱耶氏菌)檢驗方法。
      本標準適用于出口冷凍和生鮮的豬肉、豬舌、雞肉、蝦和蝦仁中耶氏菌檢驗。其他
    食品可參照使用。 

    2 樣品制備及增菌培養

    2.1 如為冷凍食品,應于2~5℃下不超過18h解凍。若不能及時檢驗,應放于—15℃保存,
    最多不能超過2 d。非冷凍易腐的食品應置于4℃冰箱保存,最多不得超過3d。
    2.2 無菌操作稱取剪碎后的樣品25g(豬舌應剪取舌根、舌兩側及舌尖部肉),置于裝有
    225mL改良的磷酸鹽緩沖液的500mL廣口玻璃瓶中,充分振蕩(若采用均質,可將剪碎后的
    樣品25g置于滅菌均質杯內,加入25mL已滅菌的改良磷酸鹽緩沖液,以8000~10000r/min
    均質0.5min,再將均質好的樣品置入裝有200mL改良的磷酸鹽緩沖液的500mL廣口玻璃瓶
    中,充分振蕩),然后于25℃培養48±2h。吸取該培養液1mL移種于預先預熱到25℃的裝有
    9mL的5g/L氫氧化鉀溶液的試管中,使之充分混合0.5min。立即吸取該混合液2mL移種于
    預先預熱到25℃的裝有8 mL的改良的酵母浸汁-孟加拉紅肉湯的試管中,充分混合,于25
    ℃培養4~6h。

    3 分離培養

    3.1 將上述經改良的酵母浸汁-孟加拉紅肉湯增菌的培養液搖勻,以直徑3mm的接種環分
    別挑取一環劃線于表面無凝固水的含吐溫80的亞硫酸鉍瓊脂平板和含吐溫80的麥康凱瓊
    脂平板各一個,培養于25℃,含吐溫80的亞硫酸鉍瓊脂平板培養3~4d,含吐溫80的麥康凱
    瓊脂平板培養48±2h。
    3.2 觀察各瓊脂平板,有無典型或可疑耶氏菌菌落。
      耶氏菌的菌落特征見表1:
    表1 小腸結腸炎耶爾森氏菌菌落特征 
    瓊脂平板 菌落類別 菌 落 特 征  
    大小,mm  表 面 透明度 高 度 顏 色 邊 緣 形狀 
    含吐溫80的麥康凱瓊脂 A 1~1.5 粗糙, 有多層環狀皺折 不透明 枕狀,中心呈乳頭狀凸起 淡粉紅色, 菌落周圍繞有毛玻璃樣淡粉紅色暈 不整齊 圓形 
    B 1~1.5 光滑、濕潤 半透明 扁 平 淡粉紅色, 菌落周圍繞有毛玻璃樣淡粉紅色暈 整 齊 圓形 
    C 1~3.0 光滑、濕潤 半透明 扁 平 淡橙粉紅色  有細微散射狀皺折 圓形 
    D 1~1.5 粗糙, 有多層環狀皺折  不透明 枕狀、中心呈乳頭狀凸起  淡粉紅色, 菌落周圍培養基為透明淡薔薇紅色 不整齊  圓形 
    含吐溫80的亞硫酸鉍瓊脂 E  針尖~ 3.0 光 滑 不透明 扁平或凸起 黑綠色或黑灰色至漆黑色,菌落周圍培養基有時有黑綠色微粒彌漫 整 齊 圓形 
    F  2~3 粗糙, 有多層環狀皺折 不透明 扁平, 有時中心呈乳頭狀凸起 灰綠色, 菌落周圍繞有淺灰綠色或藍綠色毛玻璃樣暈 不整齊 圓形 

    4 鑒定

    4.1 篩選試驗
    4.1.1 每種瓊脂平板至少應挑取兩個典型或可疑菌落,分別用光滑的接種針穿刺并密布
    地接種于改良的克氏雙糖鐵瓊脂各一管,于25℃培養24±2h。 
    4.1.2 挑取菌落后的瓊脂平板,應置于5~8℃至少保留24 h,以備必要時復查。
    4.1.3 按表2試驗結果進行判斷。
          表2 改良的克氏雙糖鐵瓊脂篩選小腸結腸炎耶爾森氏菌
    改良的克氏雙糖鐵瓊脂 初步判斷 
    斜 面  底 層 產 氣 硫化氫 
    A A -(+) - 可疑小腸結腸炎耶爾森氏菌 
    A A + +  非小腸結腸炎耶爾森氏菌 
    A A + - 
    K A + + 
    K A - - 
        注:K產堿,A產酸;+陽性反應;-陰性反應;(+)偶見少量小氣泡。

    4.2 生化試驗
    4.2.1 刮取一滿環(直徑3mm)符合表 2的典型或可疑耶氏菌特性的改良克氏雙糖鐵瓊脂
    斜面培養物,接種于裝有1mL Rustigian氏尿素培養基(改良法)的10 mm×100 mm的試管
    中,手搖或于電動快速混合器上振搖5~6s,然后于25℃培養,每隔半小時觀察一次,培養觀
    察至4h。
    4.2.2 將尿素酶試驗陽性的改良克氏雙糖鐵瓊脂斜面培養物按表3所列生化項目(尿素酶
    試驗除外)進行生化試驗,培養于25℃,氨基酸脫羧酶試驗培養24~30h,其他生化試驗陰
    性結果的應培養觀察4d。

       表3 小腸結腸炎耶爾森氏菌生化反應與血清學試驗結果判定 
    生 化 反 應 血清學試驗 結果判定 
    尿素酶試驗 鳥氨酸脫羧酶試驗 賴氨酸脫羧酶試驗  蔗糖試驗 山梨醇試驗 L-阿拉伯糖試驗 鼠李糖試 驗  西蒙氏枸櫞酸鹽試驗 
    + + - + + + - - "O"因子血清試驗陽性 小腸結腸炎耶爾森氏菌( 典型 ) 
    + + - - + + - - "O"因子血清試驗陽性 小腸結腸炎耶爾森氏菌(非典型 ) 
    + - - - - + - - "O"因子血清試驗陽性 
    + + - + + + + + "O"因子血清試驗陽性 
    + + - + + + + - "O"因子血清試驗陽性 
    + + - + + + - + "O"因子血清試驗陽性 

    注:+陽性反應;-陰性反應。 

    4.2.3 觀察生化反應結果,將符合表3耶氏菌特性的,按4.3進行血清學試驗;如不符合
    表3 所列生化反應,特別是尿素酶試驗陰性或賴氨酸脫羧酶試驗陽性為非小腸結腸炎耶
    爾森氏菌。
    4.3 血清學試驗
      在潔凈的載玻片上加一滴“O”因子血清,將待試培養物混入其內,使成為均一性混
    濁懸液,將玻片輕輕搖動0.5~1 min,在黑色背景下觀察反應。如在2min內出現比較明顯
    的小顆粒狀凝集者,即為陽性反應,反之則為陰性,另用生理鹽水作對照試驗,以檢查有無
    自凝現象。
    4.4 根據4.2和4.3試驗結果,按照表3進行判定。
      如生化反應結果完全符合表3耶氏菌特性,但與所有“O”因子血清均不發生凝集反應
    者,其菌落典型,鏡檢為革蘭氏陰性、無芽胞小短桿菌,可按《Bergey氏細菌學鑒定手冊》
    最新版擴大必要的生化試驗,判定為可疑小腸結腸炎耶爾森氏菌,并送交上一級單位鑒定。

    5 報告結果 

    5.1 報告陽性結果:“檢出小腸結腸炎耶爾森氏菌”。 
    5.2 報告陰性結果:“未檢出小腸結腸炎耶爾森氏菌”。 

    6 培養基 

    6.1 改良的磷酸鹽緩沖液 
      磷酸氫二鈉                8.23g
      磷酸二氫鈉(含1個結晶水)         1.20g
    氯化鈉                  5.00g
      山梨醇 10.00g
      膽鹽(3號)                 1.50g
      蒸餾水 1000mL
      將前三種成分溶于水中,再加入后兩種成分,溶解后調至pH7.6,分裝于500mL廣口玻
    璃瓶內,每瓶225mL,高壓滅菌121℃15min。
    6.2 改良的酵母浸汁-孟加拉紅肉湯(modified yeast extract-rose bengal broth)
    6.2.1 基礎液
      磷酸二氫鉀 0.508g
      磷酸氫二鈉 11.21g
      酵母浸汁                 5.00g
      氯化鈉                  1.00g
      硫酸鎂(含7個結晶水)          0.01g
      蒸餾水 770mL
      將上述各成分溶于蒸餾水中,加熱使之完全溶解,調至pH8.0,121℃高壓滅菌15min。
    6.2.2 40 g/L山梨糖水溶液:100.00 mL。
    6.2.3 10 g/L丙酮酸鈉水溶液:100.00mL。
    6.2.4 4g/L孟加拉紅水溶液:10.00 mL。
    6.2.2, 6.2.3溶液流通蒸汽加熱0.5h滅菌,6.2.4溶液過濾除菌,將滅菌過的此三種
    溶液加到滅菌、冷卻的基礎液中,調至最終pH為8.0,以無菌操作分裝于18mm×180mm滅菌
    的試管中,每管8mL,4℃冰箱保存備用。
    6.3 含吐溫80的麥康凱瓊脂
      蛋白胨 12.00g
      (月示)蛋白胨(proteose peptone) 3.00g
      乳糖 10.00g
      膽鹽(3號)               1.50g
      氯化鈉                5.00g
      吐溫80(Tween 80)           10.00g
      氯化鈣(無水)             0.20g
      中性紅 0.03g
      結晶紫 0.001g
      瓊脂 18.00g
      蒸餾水 1000mL
      將瓊脂于800mL蒸餾水中加熱溶化,以50mL蒸餾水將吐溫80稀釋,再將其他各成分(指
    示劑除外)加入150mL蒸餾水中,加熱使之完全溶解。將后二種溶液加至已溶化的瓊脂液
    中,充分混勻, 調至pH7.1±0.2,再加入指示劑,混勻后121℃高壓滅菌15min,待冷至50~
    55℃時,立即傾注于滅菌平皿內,每皿約15 mL,制成的瓊脂平板呈淡橙色。
    6.4 含吐溫80的亞硫酸鉍瓊脂
    6.4.1 基礎液
      牛肉膏                   5.00g
      蛋白胨 10.00g
      葡萄糖                   5.00g
      氯化鈉                   5.00g
    吐溫8O(Tween 80)              10.00g
      氯化鈣(無水)                0.20g
      瓊脂 20.00g
      蒸餾水 1000mL
    6.4.2 亞硫酸鉍混合液
    6.4.2.1 溶解200 g無水亞硫酸鈉于1000 mL蒸餾水中,配成200 g/L水溶液。
    6.4.2.2 溶解50 g枸櫞酸鉍銨于500 mL蒸餾水中,配成100g/L水溶液,加1mL濃的氫氧化
    銨,放置至澄清,可能還需再加數毫升氫氧化銨。加此溶液于6.4.2.1溶液中并混合之。
    6.4.2.3 加100 g無水磷酸氫二鈉并混合之。
    6.4.2.4 加10 g枸櫞酸鐵銨于100 mL蒸餾水中,配成100 g/L水溶液。并將此液加入上
    述的6.4.2.1、6.4.2.2、6.4.2.3的混合液中。
      將混合液于100℃加熱2 min或3 min,用橡皮塞塞瓶,儲存于室溫暗處,不可放于冰箱
    內。
    6.4.3 加70mL亞硫酸鉍混合液于1000 mL經121℃滅菌15min并冷至70℃左右的基礎液中,
    徹底搖勻,再加4 mL 10g/L煌淥水溶液,混勻,待冷至50℃左右時傾注平皿。制成的平板
    應為淡乳黃色、不透明,存放于室溫暗處或冰箱內,以臨用前一天制備為宜。
    6.5 改良的克氏雙糖鐵瓊脂
      牛肉膏                 3.00g
      酵母膏                 3.00g
      蛋白胨 15.00g
      (月示)蛋白胨              5.00g
      山梨醇 20.00g
      葡萄糖                 1.00g
      硫酸亞鐵                0.20g
      氯化鈉                 5.00g
      硫代硫酸鈉           0.30g
      酚紅                  0.024g
      瓊脂 15.00g
      蒸餾水 1000mL
      以800mL蒸餾水將瓊脂加熱溶化,再用200mL蒸餾水將其他成分(酚紅除外)加熱溶解,
    再將以上兩種溶液混勻,調至pH7.4±0.2,然后加入酚紅,分裝于13mm×130mm試管,121℃
    高壓滅菌15min,待冷至50℃左右,斜置成深高層斜面。制成的培養基為淡橙紅色。
      培養基采用高層穿刺、斜面密布劃線接種法。25℃培養24±2h。觀察結果:小腸結腸
    炎耶爾森氏菌的反應為底層斜面均產酸、變黃色、無硫化氫、不產氣(偶有少量小氣泡)。
    6.6 Rustigian氏尿素酶試驗培養基(改良法)
    6.6.1 基礎成分
      酵母浸汁                0.10g
      磷酸二氫鉀               0.091g
      磷酸氫二鈉(無水)            0.095g
      酚紅                  0.01g
      蒸餾水 900mL
      高壓滅菌121℃ 15min
    6.6.2 濃尿素液
    尿素 20.00g
    蒸餾水 100.00g
      過濾除菌
    6.6.3 將上述兩液混合,分裝于10mm×100mm的滅菌試管中,每管約1 mL左右。制成的培
    養基為淡橙黃色,尿素酶反應陽性者培養基由淡橙黃色變為桃紅色,陰性者顏色不變。
    6.7 鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶試驗培養基
    6.7.1 基礎液
      蛋白胨                 5.00g
      牛肉膏                 5.00g
      溴甲酚紫(16 g/L)           0.625mL
      甲基紅                2.50mL
      葡萄糖                 0.50g
      鹽酸吡哆素(維生素B6,pyridoxine)    0.005g
      蒸餾水     1000mL
      調至pH6或6.5
    6.7.2 基礎液分成三等分,第一部分不加任何氨基酸,分裝試管作對照用;第二部分按
    10g/L加入L-賴氨酸雙鹽酸鹽;第三部分按10g/L加入L-鳥氨酸雙鹽酸鹽。若使用DL氨基
    酸,應相應地于培養基中按2%濃度加入。加入氨基酸后應再調pH,然后分別分裝于10mm
    ×100mm試管中,121℃高壓滅菌10 min。
    6.7.3 培養基接種后,應加一層液體石蠟(約10mm厚),于25℃培養24~30h。陽性反應者
    為紫色或紅紫色,弱陽性者為青灰色,陰性反應為黃色。
    6.8 糖發酵培養基
    6.8.1 糖發酵肉湯基礎液
      蛋白胨          10.00g
      牛肉膏                3.00g
      氯化鈉                5.00g
      Andrade氏指示劑 10.00g
      蒸餾水 1000mL
      調至pH7.1~7.2
    6.8.2 蔗糖、山梨醇最終使用濃度為10g/L,可于滅菌前加入基礎液中,分裝試管,121℃
    高壓滅菌10min。L-阿拉伯糖和鼠李糖最終使用濃度為10g/L,應先配成100g/L水溶液,L-
    阿拉伯糖水溶液流通蒸汽滅菌30min,鼠李糖水溶液121℃高壓滅菌10min,然后分別以無
    菌操作加入先經121℃高壓滅菌15min的基礎液中,無菌操作分裝于已滅菌的13mm×130mm
    試管中,每管3mL。
    6.8.3 Andrade氏指示劑
      蒸餾水 100.0mL
      酸性復紅               0.50g
      氫氧化鈉(1.0moL/L)         16.00mL
      將酸性復紅溶于蒸餾水中,并加入氫氧化鈉,數小時后,如復紅褪色不夠,再加1 mL
    或2mL氫氧化鈉溶液,此試劑如保存時間較長則效果更好。
    6.8.4 此培養基制成后近于無色,接種后于25℃培養24±2h,陰性反應應繼續培養觀察
    4d。陽性反應為紅色,陰性反應則顏色不變。
    6.9 西蒙氏枸櫞酸鹽瓊脂
      硫酸鎂                0.20g
      氯化鈉                5.00g
    磷酸二氫按         1.00g
      磷酸氫二鉀              1.00g
      枸櫞酸鈉               2.00g
      瓊脂 20.00g
      蒸餾水 1000mL
      加1:500溴麝香草酚藍指示劑溶液40mL,混勻,分裝13mm×130mm試管,每管約4mL。
    121℃高壓滅菌15 min。斜置試管使成2.5cm高層和4 cm長的斜面。
      制成的培養基為透明、草綠色,接種后于25℃培養24±2h,陰性反應者觀察4d。陽性
    反應者斜面變為藍色,陰性反應則顏色不變。
    6.10 5g/L氫氧化鉀溶液
    6.10.1 標準溶液
      稱取40 g氫氧化鉀,溶于經121℃高壓滅菌30 min的5g/L氯化鈉溶液中,使成400g/L
    氫氧化鉀標準溶液,于4 ℃保存備用。
    6.10.2 取1mL400g/L氫氧化鉀標準溶液,加入經121℃高壓滅菌30 min的79mL5g/L氯化
    鈉水溶液中,分裝于已滅菌的18mm×180mm試管中,每管9mL,此溶液應用前新鮮配制。
    6.11 “O”因子血清。


    附 錄 A
    食品中小腸結腸炎耶爾森氏菌檢驗程序
    (補充件)

    ┏━━━━━━━━━━━━━━━┓
    ┃ 25g 樣品剪碎 (或均質)    ┃ 
    ┗━━━━━━━┯━━━━━━━┛
            ↓ 
    ┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
    ┃ 225mL改良的磷酸鹽緩沖液振蕩25℃, 48±2h ┃
    ┗━━━━━━━━━━┯━━━━━━━━━━┛
               ↓ 移入1mL
    ┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
    ┃ 9mL 5g/L氫氧化鉀溶液25℃, 0.5min    ┃
    ┗━━━━━━━━━━┯━━━━━━━━━━┛
               ↓ 移入2mL
    ┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
    ┃ 8mL改良的酵母浸汁-孟加拉紅肉湯25℃, 4~6h┃
    ┗━━━━━━━━━━┯━━━━━━━━━━┛
               ↓ 
    ┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
    ┃       含吐溫80的麥康凱瓊脂 含吐溫80的亞硫酸鉍瓊脂 ┃
    ┃           25℃, 48±2h 25℃, 3~4d      ┃
    ┗━━━━━━━━━━━━━━┯━━━━━━━━━━━━━━┛
                   ↓ 
    ┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
    ┃改良的雙糖鐵瓊脂25℃, 24±2h       ┃
    ┗━━━━━━━━━━┯━━━━━━━━━━┛
               ↓ 
    ┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
    ┃ Rustigian氏尿素25℃, 4h         ┃
    ┗━━━━━━━━━━┯━━━━━━━━━━┛
               ↓ 
    ┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
    ┃ 鳥氨酸脫羧酶賴氨酸脫羧酶試驗 蔗糖、山梨醇、鼠李糖、阿拉伯糖、 ┃
    ┃ 25℃, 24~30h 枸櫞酸鹽25℃, 1~4d               ┃
    ┗━━━━━━━━━━━━━━┯━━━━━━━━━━━━━━━━━┛
                   ↓ 
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    ┃ 血清學試驗        ┃
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    附加說明:
    本標準由中華人民共和國國家進出口商品檢驗局提出。
    本標準由中華人民共和國天津進出口商品檢驗局起草。
    本標準主要起草人齊素瑛、郝士海。
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    中華人民共和國國家進出口商品檢驗局1992-12-28批準 1993-05-01實施

     

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