病毒細胞培養法及病變觀察

  細胞培養法是目前培養病毒應用最廣的一種培養方法，其優點是（1）經濟適用，結果正確且敏感；（2）較實驗動物易于控制。細胞培養法多應用于病毒的分離培養，進行血清中和試驗及制造疫苗和抗原等方面。很多組織細胞，包括雞胚、鼠胚、各種動物的腎組織細胞，人胚羊膜組織細胞或流產胎兒組織細胞（應在死后6 小時內采取，因時間過長，組織細胞生長成功率下降）等均可作細胞培養的來源。

  細胞的選擇主要依據組織細胞對病毒的敏感性。能引起病變的組織細胞，往往取自病毒的自然宿主，特別是引起疾病的宿主的某些臟器組織細胞。人類病毒，用人或猴的組織細胞較敏感，但這不是絕對的，如地鼠腎細胞較人腎細胞對流行性乙型腦炎病毒敏感。

（一） 原代細胞培養法

【材料】

9～10 日齡雞胚、Hanks 氏溶液、0.25％胰酶溶液、無菌小剪、鑷子、無菌培養皿、毛細吸管、吸管、沉淀管、無菌細胞培養管（抗生素空瓶）、100 毫升無菌玻璃瓶或三角燒瓶、備有四層紗布的玻璃漏斗。

【方法】

1．用碘酒消毒雞胚蛋氣室外殼，并將它直立于蛋架上，以鑷子將雞胚取出放入無菌培養皿內，去頭爪及內臟。

2．用小剪在培養皿內將胚胎剪成小塊（4～5 毫米3），加Hanks 氏溶液（約10毫升）沖洗，靜置1～2 分鐘后，用毛細吸管吸取液體。依同法再洗滌2 次，將血球充分洗去。

3．用鑷子將組織塊放入無菌玻璃瓶或三角燒瓶內，加入10～15 毫升0.25％胰酶溶液，37℃水浴20 分鐘，中間搖動幾次。由于胰酶的作用可使大量細胞游離，液體變混。經四層紗布過濾后的細胞懸液，低速離心沉淀（1000 轉/分以內）5 分鐘，吸取上清液，沉淀物加入適量營養液，用白細胞計數的方法進行計數，使成每毫升含50～80 萬細胞懸液以作單層細胞培養。

4．每一細胞培養管，注入細胞懸液1 毫升，蓋好瓶塞，并將瓶略加搖動，橫臥于有槽木架上，使細胞均勻平鋪于管壁。置37℃溫箱孵育，一般4 小時，細胞附著于管壁，48 小時可長成單層，此時即可調換營養液，接種病毒。

（二） 傳代細胞培養法

從人及動物組織，特別是腫瘤組織，經過多次傳代可建立傳代細胞系。這種細胞能無限地傳代，但并不是所有的組織細胞都能建立傳代細胞。有一些傳代細胞對病毒敏感范圍較廣，曾被利用作病毒的分離和鑒定。如HeLa 細胞，Hep－2 細胞及KB 細胞。HeLa 細胞對脊髓灰質炎三型病毒，腺病毒及大多數實驗室適應的ECHO 病毒都敏感。Hep－2 細胞也曾用來分離脊髓灰質炎病毒、柯薩奇A 組病毒、腺病毒、RS 病毒。HeLa 細胞來自子宮頸癌，Hep－2 細胞來自喉癌，而KB 細胞來自上腭癌。由于傳代細胞有致腫瘤作用，目前僅用做病毒的分離鑒定及一些病毒學的研究而不能用于疫苗的生產。

【材料】

單層細胞培養瓶，營養液，0.25％胰蛋白酶溶液，無菌吸管，無菌細胞瓶。

【方法】

1．將成片細胞的生長液倒掉，用Hanks 液洗一次。

2．加入適量的0.25％胰蛋白酶，37℃孵育1 分鐘。

3．將細胞瓶倒放，細胞在上，胰酶在下，繼續孵育37℃5～10 分鐘。

4．將胰蛋白酶倒掉，再加入原量的生長液，用10 毫升吸管吹打分散細胞。

5．用生長液按原量3～4 倍稀釋，即一瓶細胞能傳3～4 瓶。

（三） 細胞培養接種病毒的方法及病變觀察

【材料】

單層細胞培養管、營養液、Hanks 溶液、無菌毛細滴管和腺病毒稀釋液。

【方法】

1．取已長成單層細胞的培養瓶二只，用無菌毛細滴管吸去管中液體，用Hanks溶液洗二次。

2．用無菌的1 毫升吸管吸稀釋的腺病毒液0.1 毫升加入一只單層細胞培養瓶中，另一只加0.1 毫升營養液不接種病毒作為對照，細胞瓶放平，使其接觸整個細胞層，置37℃作用1 小時，使病毒吸附到細胞上。

3．取出單層細胞瓶，每只中加入營養液0.9 毫升，蓋緊后置37℃孵箱中培養1～2 天。

4．取出細胞在低倍顯微鏡下觀察，注意種毒與對照二管的細胞形態，排列等。

注：為方便保存，此處觀察的細胞已經過固定和染色。

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